|
Novel binding proteins derived from small protein domains targeting diagnostically important molecules
Vaňková, Lucie ; Malý, Petr (vedoucí práce) ; Brynda, Jiří (oponent) ; Trefil, Pavel (oponent)
Rychlý vývoj technik genového inženýrství, zejména metod pro in vitro řízenou evoluci a kombinatorickou mutagenezi, umožnil rychlý rozvoj nových vazebných proteinů pro téměř jakýkoli požadovaný antigen jako alternativu k dnes široce používaným protilátkám. Tyto tzv. scaffoldy jsou často odvozeny od malých proteinových domén s užitečnými biofyzikálními vlastnostmi. Zatímco na biofarmaceutickém trhu stále dominují monoklonální protilátky, možnost snadné cílené modifikace vazebných proteinů je předurčuje především pro použití v diagnostice. ABD scaffold, odvozený od albumin vážící domény streptokokového proteinu G tvořené třemi spojenými alfa-šroubovicemi, patří do rodiny malých vazebných domén. V naší laboratoři byla na základě ABD scaffoldu vyvinuta vysoce komplexní kombinatorická knihovna vazebných proteinů. Tato knihovna byla použita k selekci nových vazebných proteinů pro lidské sérové biomarkery rakoviny prostaty PSP94, KLK2, KLK11, jež mohou být použity k vývoji nových multifaktoriálních biosenzorů pro přesnější diagnostiku rakoviny prostaty. V druhé části dizertace je popsán vývoj vazebných proteinů odvozených od ABD scaffoldu určených pro selektivní rozpoznání různých fenotypů cirkulujících nádorových buněk jako součást mikrofluidního čipu vyvíjeného pro diagnostiku plicního adenokarcinomu....
|
|
Novel protein binders targeting marker of epithelial cells
Huličiak, Maroš ; Malý, Petr (vedoucí práce) ; Anděra, Ladislav (oponent)
Presná a rýchla kvantifikácia krvných cirkulujúcich nádorových buniek (CTC) u adenokarcinómu pľúc je zásadným krokom ku zrýchleniu diagnostiky, voľbe vhodnej a včasnej terapie a k určeniu prognózy liečby. Vývoj nového typu mikrofluidného zariadenia založeného na detekcii a kvantifikácii epitelových a mezenchýmových CTC buniek prietokovým čipom pomocou selektívnych vysoko afinných kotviacich proteínov je inovatívnym riešením. Témou diplomovej práce bolo vytvoriť nové typy väzobných proteínov s vysokou väzobnou afinitou a selektivitou pre membránový glykoproteín EpCAM ako zvolený marker epitelových buniek. K identifikácii týchto väzobných proteínov bola využitá metóda riadenej evolúcie proteínov, a to použitím vysoko komplexných kombinatoriálnych knižníc odvodených od štruktúry albumín- väzobnej domény (ABD) alebo "scaffoldu Myomedinu" odvodeného od domény ľudského svalového proteínu. Výsledkom diplomovej práce je vyvinutie unikátnej zbierky vysoko afinných proteínov cielených proti rekombinantnému EpCAM a ich následná sekvenčná, biochemická a funkčná charakterizácia. Vybrané varianty proteínov môžu byť riešením pre selektujúce terčové proteíny imobilizované k povrchu mikrofluidného čipu. Kľúčové slová: epitelová bunka, EpCAM, väzobný proteín, ribozomálny displej, kombinatoriálna knižnica, proteínový...
|
|
Novel protein binders targeting marker of epithelial cells
Huličiak, Maroš ; Malý, Petr (vedoucí práce) ; Anděra, Ladislav (oponent)
Presná a rýchla kvantifikácia krvných cirkulujúcich nádorových buniek (CTC) u adenokarcinómu pľúc je zásadným krokom ku zrýchleniu diagnostiky, voľbe vhodnej a včasnej terapie a k určeniu prognózy liečby. Vývoj nového typu mikrofluidného zariadenia založeného na detekcii a kvantifikácii epitelových a mezenchýmových CTC buniek prietokovým čipom pomocou selektívnych vysoko afinných kotviacich proteínov je inovatívnym riešením. Témou diplomovej práce bolo vytvoriť nové typy väzobných proteínov s vysokou väzobnou afinitou a selektivitou pre membránový glykoproteín EpCAM ako zvolený marker epitelových buniek. K identifikácii týchto väzobných proteínov bola využitá metóda riadenej evolúcie proteínov, a to použitím vysoko komplexných kombinatoriálnych knižníc odvodených od štruktúry albumín-väzobnej domény (ABD) alebo "scaffoldu Myomedinu" odvodeného od domény ľudského svalového proteínu. Výsledkom diplomovej práce je vyvinutie unikátnej zbierky vysoko afinných proteínov cielených proti rekombinantnému EpCAM a ich následná sekvenčná, biochemická a funkčná charakterizácia. Vybrané varianty proteínov môžu byť riešením pre selektujúce terčové proteíny imobilizované k povrchu mikrofluidného čipu. Kľúčové slová: epitelová bunka, EpCAM, väzobný proteín, ribozomálny displej, kombinatoriálna knižnica, proteínový...
|
|
Novel binding proteins derived from small protein domains targeting diagnostically important molecules
Vaňková, Lucie ; Malý, Petr (vedoucí práce) ; Brynda, Jiří (oponent) ; Trefil, Pavel (oponent)
Rychlý vývoj technik genového inženýrství, zejména metod pro in vitro řízenou evoluci a kombinatorickou mutagenezi, umožnil rychlý rozvoj nových vazebných proteinů pro téměř jakýkoli požadovaný antigen jako alternativu k dnes široce používaným protilátkám. Tyto tzv. scaffoldy jsou často odvozeny od malých proteinových domén s užitečnými biofyzikálními vlastnostmi. Zatímco na biofarmaceutickém trhu stále dominují monoklonální protilátky, možnost snadné cílené modifikace vazebných proteinů je předurčuje především pro použití v diagnostice. ABD scaffold, odvozený od albumin vážící domény streptokokového proteinu G tvořené třemi spojenými alfa-šroubovicemi, patří do rodiny malých vazebných domén. V naší laboratoři byla na základě ABD scaffoldu vyvinuta vysoce komplexní kombinatorická knihovna vazebných proteinů. Tato knihovna byla použita k selekci nových vazebných proteinů pro lidské sérové biomarkery rakoviny prostaty PSP94, KLK2, KLK11, jež mohou být použity k vývoji nových multifaktoriálních biosenzorů pro přesnější diagnostiku rakoviny prostaty. V druhé části dizertace je popsán vývoj vazebných proteinů odvozených od ABD scaffoldu určených pro selektivní rozpoznání různých fenotypů cirkulujících nádorových buněk jako součást mikrofluidního čipu vyvíjeného pro diagnostiku plicního adenokarcinomu....
|
|
Selection approaches in directed evolution of binding proteins
Huličiak, Maroš ; Malý, Petr (vedoucí práce) ; Hlouchová, Klára (oponent)
Umelo vytvárané väzobné proteíny odvodené od malých proteínových domén lákajú čoraz väčšiu pozornosť ako alternatívy k monoklonálnym protilátkam a majú široké spektrum využitia. Svoju aplikáciu si našli v oblastiach diagnostiky rôznych onemocnení, sú prísľubom pre vývoj vakcín proti globálnym ochoreniam ako je AIDS, môžu mať terapeutický potenciál a skvalitňujú purifikačné a chromatografické metódy. Na selekciu proteínových variánt, ktoré majú najlepšie väzobné vlastnosti sa v súčasnosti využíva viac než desať selekčných, tzv. displejových techník. Displejové techniky využívajú rôzne vektory pre vystavovanie proteínových variánt ako je tomu napríklad u fágového, kvasinkového, retrovirálneho či bakulovirálneho displeja. Selekcia taktiež môže prebiehať in vitro. Príkladom je ribozomálny displej, mRNA displej a CIS displej. Evolúcia displejových selekčných techník umožnila selekciu postranslačne glykosylovaných, fosforylovaných či acylovaných proteínov, prispela k zvyšovaniu výťažku selektovaných ligandov a k skvalitneniu ich väzobných vlastností. Práca popisuje a porovnáva vybrané selekčné metódy, pojednáva o výhodách a limitáciach ich kombinatoriálnych knižníc peptidov a uvádza praktické využitie väzobných proteínov odvodených od malých proteínových domén.
|